L’antico DNA di un’uva desertica perduta delle Highlands del Negev rivela un lignaggio del vino tardo dell’antichità

Dal blog https://www.pnas.org/

17 aprile 2023A cura di Dorian Q. Fuller, University College London, London, Regno Unito

Il suo significato

La moderna industria vinicola dipende fortemente da un numero limitato di cultivar europee, che sono più adatti per la coltivazione in climi temperati. Il riscaldamento globale sottolinea la necessità di diversità in questa coltura agricola ad alto impatto. I lignaggi di viticoli allevati in regioni calde e aride, spesso conservati nel corso dei secoli, possono presentare un’alternativa alle classiche cultivar di uva vinicola. Il nostro studio di un’eredità di vitigni dal deserto delle Highlands del Negev del sud di Israele fa luce sulla sua genetica, sulle proprietà biologiche e sull’impatto duraturo. I parenti stretti delle uve archeologiche possono ora fornire una piattaforma eccezionale per gli studi futuri sulla resilienza alla vite all’aridità.

Astratto di testo

Recenti scavi di insediamenti tardivi nell’altopiano del Negev del sud di Israele hanno scoperto una società che ha stabilito una viticoltura su scala commerciale in un ambiente arido. Fuks et al., Proc. – Natl. – Acad. – Sci, colpa. – Si’. Gli Stati Uniti117, 19780-19791 (2020)]. Abbiamo applicato il sequenziamento del genoma arricchito e la datazione al radiocarbonio per esaminare i semi della vite che sono stati scavati in tre di questi siti. Le nostre analisi hanno rivelato una coltivazione di uva lunga e continua nei Levante meridionale. I semi geneticamente diversificati hanno anche fornito indizi sulle antiche strategie di coltivazione volte a migliorare la produttività agricola e garantire la sicurezza alimentare. Applicando l’analisi della previsione genomica, un pip datato all’VIII secolo CE è stato determinato probabilmente da un’uva bianca, fino ad oggi il più antico da identificare. In un’analisi a parentela, un altro pip è stato trovato per essere discendente da una cultivar greca moderna ed era quindi collegato a diversi vini storici popolari che una volta erano scambiati in tutto l’Impero bizantino. Queste scoperte fanno luce sulle storiche reti commerciali bizantine e sul contributo genetico delle varietà levane al classico paesaggio egeo.

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La vite (Vitis vinifera, subsp. vinifera) svolge un ruolo economico e culturale vitale in tutto il mondo. Dalla domesticazione del vitigno selvatico (V. vinifera, subsp. sylvestris) nel sud-ovest asiatico oltre 6.000 y fa (1, 22), è stato coltivato principalmente per il vino 3(3). La viticoltura (grape in crescita) e la viticoltura (vino) si sono evolute lungo molteplici percorsi storici in diverse regioni vinicole e hanno prodotto una miriade di cultivar legacy che crescono nel loro particolare terroir.

Delle migliaia di vitigni vinicole esistenti, solo 11 cultivar di origine europea (Cabernet Sauvignon, Chasselas, Chardonnay, Grenache, Merlot, Monastrell, Pinot Nero, Riesling, Sauvignon Blanc, Syrah e Ugni Blanc) coprono più di un terzo dei vigneti di vinificazione in tutto il mondo (4 – 6). Questo numero notevolmente piccolo di cultivar è coltivato in una zona geografica relativamente ristretta (4, 5) con insiemi generalmente fissi di condizioni climatiche, esponendo l’industria vinicola a fattori di stress come il riscaldamento globale. Un recente studio ha rilevato che un aumento di 2 gradi centigradi a temperature mediane in tutto il mondo devasterebbe la coltivazione della vite in più della metà delle attuali aree viticole 6(6). Ciò è supportato da un aumento delle prove che le variazioni di temperatura influenzano il tempo di maturazione della vite, influenzando la qualità delle bacche e del vino 7(7). Un aumento della diversità molto probabilmente mitigherebbe questo effetto e potrebbe persino invertirlo 6(6). Pertanto, le varietà endemiche di vitigni nelle regioni aride offrono una prospettiva di resilienza delle colture al cambiamento climatico.

La regione delle Highlands del Negev è un altopiano nel sud di Israele. È caratterizzato da aridità (indice di aridità inferiore a 0,10; precipitazioni medie annue da 80 a 100 mm / a) 8(8), siccità estive recise e temperatura diurna (calda/fredda). Storicamente, gli agricoltori regionali hanno approfittato della geografia locale e della prevedibilità delle precipitazioni stagionali per raccogliere ampie acque piovane per i loro raccolti. Recenti scavi di insediamenti urbani bizantini / antichi islamici nelle Terre del Negev hanno esposto una società desertica che esisteva nel IV-IX secolo d.C. ed è stata sostenuta da una sofisticata agricoltura secca che includeva una prospera viticoltura, in particolare nel V-XVI secolo 9(9). Il vino prodotto nel Negev è stato commercializzato all’estero e ha raggiunto una formidabile reputazione internazionale 10(10). Recenti studi hanno monitorato l’ascesa della viticoltura del Negev in concomitanza con il coinvolgimento in reti commerciali circum-mediterranee che collegano le regioni del Medio Oriente con l’Europa e ha notato un significativo calo della vinificazione su scala commerciale dalla metà del Sei secolo d.C. (9, 11). Nonostante l’Islamico primitivo (VII-XVII-XX secolo) e l’applicazione Mamelucco (XIII secolo) della legge musulmana che vieta la produzione e il consumo di vino, le viti continuarono ad essere coltivate per il consumo locale di uva da tavola, uvetta e, in quantità limitata, vino cerimoniale tra ebrei e cristiani (12,13). Tuttavia, la conoscenza della vite specifica coltivata nel Negev è andata perduta.

Mentre la moderna industria vinicola israeliana si basa sulle nobili 11 varietà (14), la regione contiene anche razze di vite selvatiche, che presumibilmente discendono da quelle utilizzate per produrre i vini storici raffigurati nella letteratura e nella teologia giudaico-cristiana. Negli ultimi 150 anni, decine di cultivar indigene del Levante meridionale sono state raccolte, studiate e descritte (15-1717). Sulla base di analisi delle frequenze di allele microsatellite (16, 18) e delle sequenze genomiche (19), le cultivar endemiche sono state trovate per formare un gruppo geneticamente distinto. Oggi, le cantine e i monasteri specializzati producono piccoli lotti di vini utilizzando queste cultivar. Tuttavia, rimane sconosciuto se queste varietà presumibilmente genuine sono infatti il prodotto di un’antica coltivazione continua locale e sono geneticamente legate alle antiche cultivar della regione.

I recenti progressi nelle tecniche paleogenomiche stanno trasformando la nostra comprensione della diversità della cultivar del passato fornendo preziosi set di dati per lo studio delle piante di cimelio nell’antichità (20, 21). Ad esempio, l’antico DNA (aDNA) estratto dai semi dell’uva francese ha mostrato che il pedigree di alcune cultivar del patrimonio dell’Europa occidentale è radicato in epoca medievale e romana (22). Sorprendentemente, un esemplare di 900 anni è stato identificato come il clone genetico di Savagnin Blanc, una cultivar francese popolare, che offre prove di secoli di propagazione clonale ininterrotta.

Qui, riportiamo i risultati del sequenziamento a livello di genoma arricchito dal bersaglio sul DNA estratto da antichi semi d’uva trovati in una stanza sigillata costruita in pietra nell’antico insediamento di Avdat (Oboda) negli Highlands del Negev (23). Lo stile architettonico nel complesso è bizantino e affronta uno spazio di abitazione rupestre con pitture monastiche paleocristiane. Al di sopra del fondo del periodo bizantino, spessi accumuli di sterco essiccato con abbondanti semi d’uva inesplorati sono stati datati al primo periodo islamico (SI Appendice, Tabella S1). Per espandere la nostra ricerca, abbiamo anche sequenziato le moderne cultivar indigene e le uve selvatiche raccolte da tutto Israele. Le analisi comparative dei set di dati moderni e antichi e delle cultivar sequenziate provenienti da tutto il mondo hanno fornito approfondimenti sull’eredità genetica delle uve della tarda antichità. Inoltre, abbiamo scoperto che uno degli antichi esemplari può essere collegato con un’eccellente stirpe vitivinicola i cui progenie sono ancora oggi coltivati.

I risultati

DNA di campioni nativi archeologici e moderni.

Abbiamo estratto 16 semi archeologici di vite da quattro siti archeologici in Israele (Fig. 1 e SI Appendice, Capitolo 1 e Tabelle S1 e S4). Sei pips hanno prodotto con successo il DNA e sono stati dimezzati. Una metà è stata utilizzata per l’estrazione del DNA e l’altra metà per la datazione al radiocarbonio. Le date del radiocarbonio variavano dalla fine del VII al X secolo d.C. (Appendice SI, tabella S1). Alla fine, cinque pips sono stati utilizzati in questo studio. I modelli di misincorporazione del nucleosoide (24, 25) e le distribuzioni di lunghezza di lettura osservate nei dati sequenziati erano coerenti con quelli previsti dal DNA degradato.

– Fig. 1.

Abbiamo anche campionato e sequenziato i giovani tessuti fogliari di 33 varietà di vite selvatiche e addomesticate provenienti da tutto Israele. Alla fine, in questo studio sono stati utilizzati nove campioni unici (Fig. 1 e SI Appendice, Tabelle S2 e S5). I campioni antichi e moderni sono stati arricchiti per 10.000 polimorfismi a nucleoloce (SNP) (28) e poi sequenziati. Abbiamo aggiunto i genotipi di centinaia di adesioni dai pannelli di diversità GrapeRefSeq (28, 29) e altri genomi dell’uva disponibili al pubblico da diversi progetti del Centro nazionale per l’informazione biotecnologica (NCBI) (19, 30, 31) (appendice, tabella S3).

A causa dell’elevata variabilità nella qualità tra gli antichi campioni, abbiamo deciso di creare due set di dati separati che massimizzavano il numero di SNP nelle analisi (6.928 SNP e tre antichi campioni; copertura X10-X40) o massimizzavano il numero dei campioni archeologici (1.032 SNP e cinque campioni antichi; copertura X4.6 -X59). Per maggiori dettagli, vedi .

Campioni archeologici si adattano all’interno del cluster genetico dei coltivatori levantini meridionali.

Un’analisi dei componenti principali (PCA) di 934 adesioni di viticoli provenienti dall’Europa, dall’Asia occidentale e centrale e dal Nord Africa mostra che la variazione spiegata dal primo componente principale può essere principalmente attribuita alle differenze tra i campioni selvatici e coltivati (appendice SI, Fig. Il mio sito S4). Ciò è coerente con i risultati degli studi precedenti (30, 32).

Quando furono analizzate solo le adesioni coltivate, fu rivelata una struttura genetica triangolare (Fig. 2 A). Un bordo del triangolo delinea l’asse dall’Europa occidentale e centrale alla penisola iberica. Un altro vantaggio delinea l’asse dall’Europa occidentale attraverso l’Europa orientale all’Asia e al Levante. È interessante notare che i campioni del Levante meridionale (Israele, Siria e Libano nel nostro set di dati) sono stati per lo più raggruppati strettamente insieme e sono apparsi separati da altri locali asiatici. Abbiamo ripetuto la nostra analisi delle adesioni coltivate e selvagge orientali solo (i gruppi asiatici e greci) e abbiamo scoperto che la distinzione tra i campioni del Levante meridionale è mantenuta e che i campioni archeologici di Israele si inseriscono all’interno del cluster dei campioni del Levante meridionale (Figura. 2 B).

– Fig. 2.

Per determinare se gli antichi campioni erano probabilmente coltivati di varietà, abbiamo eseguito due PCA sui campioni del Levante meridionale utilizzando entrambi i set di dati SNP. In entrambe le analisi, i campioni archeologici rientravano nella gamma coltivata (Fig. 2 C e D). Il nostro risultato è stato ulteriormente supportato da un’analisiSTRUTTURA33(33) in cui i campioni archeologici sono stati assegnati agli stessi cluster delle adesioni coltivate (Appendice SI, Fig. Il sito e il S8).

Kinship tra le adesioni del Levante meridionale.

– Fig. 3 A mostra l’inferenza della parentela tra tutte le adesioni del Levante meridionale basate su segmenti di identità condivisa da Decent (IBD) per i set di dati SNP più ampi. L’A33 e la moderna cultivar Asswad Karech, che è stata campionata in Libano, sembrano essere strettamente correlate; la loro parentela appare più forte di quella delle moderne coppie madri-progenie conosciute (Appendice, Capitolo 6 e Fig. C) S5). L’A31 e l’A32 sembrano essere legati a una misura minore e così anche A31 e Modern Be’er, una varietà selvaggia che cresce selvaggia lungo la costa meridionale israeliana.

– Fig. – 3.

– Fig. 3 B presenta l’inferenza della parentela tra i campioni archeologici e le adesioni del Levante meridionale sulla base di segmenti IBD condivisi per i set di dati SNP più piccoli. Mostra anche A33 e Asswad Karech per essere molto vicini e dà supporto a una stretta parentela tra la A31 e la A32 e tra la A31 e la Be’er. Inoltre, l’A3 archeologico sembra essere correlato ad A33 e ad Asswad Karech.

Ulteriori analisi dell’accuratezza dell’imputazione e della fase di introduzione e del modo in cui viene valutata la parentela sono mostrati nell’appendice SI, nel capitolo 6 e nei fienili. S5 e S6.

L’Asswad Karech ha propulito un Antico Uva.

Abbiamo stimato il coefficiente di parentela tra le coppie di campioni del Levantino meridionale eseguendo il programma KING (34). Il campione archeologico A33 e il moderno Asswad Karech sono stati trovati per soddisfare i criteri genitori-offspring: il coefficiente di Kinship (K) è stato stimato a 0.3017 e IBS0 a 0. IBS0 sta per le proporzioni di alleli in cui né il cromosoma è identico per stato (cioè la proporzione di omozigoti a disallineamenti omozigoti). Maggiori dettagli sui criteri delle diverse categorie di relazione sono forniti nell’Appendice SI, capitolo 8.

Permettere 45 errori di sequenziamento (per i siti diploidi 6.896; tasso di errore minimo 0,33%), tutti i genotipi A33 sono contenuti in Asswad Karech, mentre non è vero il contrario. Abbiamo ispezionato manualmente gli aplotipi a fasi e siamo stati in grado di abbinare gli aplotipi A33 ad Asswad Karech (Appendice, Fig. Il mio sito S7). Ciò implica che la A33 è discendente da Asswad Karech e da essa sola sia per l’autosbagliamento di una pianta Asswad Karech o l’allevamento di due cloni di Karech Asswad. Ci sono 1.976 siti eterozigoti a Asswad Karech e solo 913 in A33 (Appendice SI, Capitolo 5 e Fig. Il mio sito S3). Il rapporto di eterozigosi di circa 1: 2 è alla pari con una o più generazioni di allevamento autonomo / clonale. Per ulteriori dettagli, vedere Appendice SI, Capitolo 7.

Nessun’altra stretta relazione di parentela che coinvolge campioni archeologici è stata trovata utilizzando KING. Due moderni campioni israeliani nativi sono stati identificati come cloni (Ashkelon e Nitzanim [2]; K – 0,4798, IBS0 0). I risultati completi dell’analisi KING sono disponibili nell’Appendice SI, Fig. – S9.

Colore delle bacche di campioni archeologici.

In uno studio di associazione genome-wide (GWAS) di viti, 26 loci sono stati trovati per essere significativamente associati al tratto quantitativo di colore delle bacche (28). Di questi loci, 19 avevano chiamate di genotipo con alta copertura nei campioni archeologici A32 e A33. L’effetto genomico combinato dei genotipi in questi loci, noto come punteggio poligenico, viene utilizzato per stimare la predisposizione genetica di un individuo a un determinato tratto. Abbiamo calcolato i punteggi poligenici dei genotipi dei due campioni su questi loci e li abbiamo confrontati con i punteggi di 774 adesioni coltivate moderne con colore delle bacche noto. I due campioni archeologici si inseriscono nei due estremi opposti della distribuzione della partitura delle cultivar bianche e nere (Fig. 4). – Si tratta di un Sulla base di questo numero limitato di loci, possiamo identificare con cautela l’A32 come un’uva colorata leggera, probabilmente bianca. Ha ottenuto un punteggio inferiore al 97%, 90%, 82% e al 61% delle moderne cultivar nere, rosse, rosate e bianche, rispettivamente. A33 ha ottenuto un punteggio superiore a tutte le moderne cultivar bianche, rosate e rosse e del 94% delle cultivar nere, suggerendo che è molto probabilmente un’uva nera. A causa delle loro piccole dimensioni del campione, le decine di adesioni rosate e rosse moderne sono presentate separatamente nell’Appendice SI, Fig. – S10.

– Fig. – 4.

La discussione

Il riscaldamento globale ha portato alla ricerca critica di varietà di uva adattate all’aridità. In questo studio, ci concentriamo sull’arido Alteland del Negev in Israele, esaminando i semi che sono stati scavati nei siti bizantini e islamici primitivi. Abbiamo applicato tecniche radiocarbonio, paleogenomici e bioinformatici su questi pip e abbiamo scoperto che erano più strettamente correlate alle tradizionali cultivar del Levante meridionale. Questo risultato dimostra che l’ascendenza della vite del Levante meridionale risale ad almeno 1.000 y, suggerendo che le cultivar di uva del Mediterraneo orientale probabilmente hanno sviluppato alti livelli di resilienza per l’ambiente difficile.

Abbiamo dedotto la relazione genitore-progenie, per lo meno tra una moderna cultivar libanese, Asswad Karech, e uno dei campioni archeologici, A33. Molto probabilmente, A33 è un autodidatto Asswad Karech poiché la cultivar moderna contiene tutti gli aplotipi dell’esemplare archeologico ma non il contrario. Asswad Karech è una cultivar nera, caratterizzata da grandi grappoli di bacche (35). In Grecia, la stessa varietà è conosciuta con il sinonimo Syriki ed è per lo più coltivata per il consumo della tavola e raramente per il vino (35, 36). La sua origine orientale si riflette nel nome Syriki (sia “dalla Siria” o “dall’Oriente” – “squalo” in arabo). Tuttavia, questo sinonimo può avere un’interpretazione diversa. Nella letteratura biblica, Sorek è il nome di un’uva che è stata coltivata nella pianura giudaica, un’area situata tra i monti della Giudea e la pianura costiera in Israele contemporaneo (37). È interessante notare che, nell’antico ebraico, “srak” significa “rosso”, apparentemente un riferimento diretto al colore delle bacche di Sorek.

Una progenie di Asswad Karech è la cultivar greca Ladikino (38), presumibilmente intitolata all’antica città portuale siriana di Laodicea (attualmente Latakia) 36(36) che era una capitale provinciale bizantina fino alla conquista islamica nel VII secolo d.C. Il vino prodotto in Laodicea fu esportato attraverso l’Impero bizantino e oltre, raggiungendo l’Egitto, l’Arabia meridionale, l’Africa orientale e l’India (39). Dall’XI secolo, Ladikino era coltivato a Creta, dove veniva utilizzato nella produzione del famoso vino malvasia cretese (36). Il marchio Malvasia, con il quale sono stati commerciati diversi vini, si pensa derivi da Monemvasia (Malvasia in italiano) (40), un forte bizantino e città portuale situato nel sud della Grecia. I nostri risultati sono in linea con i documenti storici e confermano l’antichità di Syriki e Ladikino.

In precedenza, alcune delle cultivar tradizionali della Grecia, tra cui Syriki e Ladikino, sono state geneticamente e ampelalmente collegate al Mediterraneo orientale (35, 36). Una moltitudine di reperti archeologici in Grecia e in Europa indicano la popolarità del vino dal Negev durante il IV-VI-Sette secoli d.C. (10, 41, 42). Non siamo in grado di mettere direttamente in relazione i primi semi di uva Avdat islamici sequenziati all’industria vinicola bizantina del Negev. Tuttavia, tale connessione potrebbe essere dedotta da fonti diverse. In primo luogo, le crescenti prove suggeriscono che l’acqua piovana che raccoglie le infrastrutture agricole nel Negev, che ha raggiunto il picco nel periodo medio-bizantino, hanno continuato a essere mantenuta nel primo periodo islamico (43, 44). Questo è probabilmente vero anche per le cultivar coltivate ad Avdat. Inoltre, uno studio sull’intensità della viticoltura basato sulle frequenze dei semi dell’uva suggerisce che nel primo periodo islamico, la viticoltura è continuata nei siti monastici 9(9). Poiché i semi d’uva sequenziati sono stati trovati in un sito monastico scavato a Avdat (45), è plausibile che appartenessero a una varietà coltivata nel periodo bizantino.

Nonostante il piccolo numero di pip archeologici utilizzati in questo studio, tre pip dello stesso locus (Spit S2, Locus 21), datati indipendentemente a periodi simili, sono stati trovati geneticamente diversi. Pertanto, è possibile che una varietà di piante d’uva sia stata coltivata insieme negli stessi vigneti e possa essere stata utilizzata come miscela per produrre vino. Un’altra possibile spiegazione è che la strategia di coltivazione “multicropping” è stata impiegata ad Avdat. Le colture divergenti diminuiscono i rischi e massimizza l’utilizzo dello spazio e del lavoro sul campo ed è stato comunemente praticato con uva (13) tra le altre colture nel mondo antico (46, 47). Ciò ha permesso agli agricoltori di estendere la stagione del raccolto e aumentare la produttività agricola, ad esempio, mescolando varietà di maturazione precoce con varietà di maturazione tardiva. Le innovazioni nelle infrastrutture di raccolta e trasporto dell’acqua hanno cambiato il paesaggio fisico, consentendo l’espansione dei complessi agricoli del Mediterraneo bizantino nelle regioni aride precedentemente incolte (48). Queste tecnologie avanzate, possibilmente applicate insieme a pratiche multicolori, hanno permesso agli agricoltori di prosperare nonostante le dure condizioni del terroir arido degli altopiani del Negev. Lo studio esteso dei vitigni Avdat consente una comprensione più complessa dei metodi passati agli agricoltori utilizzati per rafforzare la capacità di carico del paesaggio e per aumentare la sicurezza alimentare (49, 50).

La diversità genetica identificata tra i pip archeologici sembra includere variazioni nel colore delle bacche. L’uva selvatica ha generalmente frutti di bosco neri, e questo è il fenotipo ancestrale nell’uva. Le variazioni di colore nella vite coltivata sono risultate fortemente associate al polimorfismo in un gruppo di geni della famiglia dei fattori di trascrizione VvMybA trovati sul cromosoma due del genoma dell’uva (51, 52). Le mutazioni in questi geni regolatori portano a un’interruzione nella produzione del pigmento antocianinico che è responsabile del colore viola nell’uva e in altre piante. Mentre l’ombra precisa è determinata quantitativamente, cioè la riduzione del numero di aplotipi funzionali compromette progressivamente la sintesi di antocianina e porta a bacche più chiare, normalmente solo la completa assenza di antocianina si traduce in uve bianche (53). Ciò si riflette nelle partiture poligene delle cultivar bianche presentate in Fig. 4, dove la maggior parte dei campioni popola l’estremità inferiore della distribuzione. Poiché la partitura poligenica del campione archeologico A32 scende al di sotto di quelle della maggior parte delle moderne uve bianche, è probabile che non abbia espresso alcun antociano.

Le cultivar di uva di colore chiaro sono oggi popolari in tutto il mondo. L’analisi basata sulla coalescenza degli aplotipi associati alla variazione di colore ha mostrato che portano la firma di una recente espansione esponenziale (51), che è stata probabilmente guidata dalla preferenza dei coltivatori. È stato proposto che gli aplotipi ancestrali abbiano origine nella penisola iberica e si diffusero verso est, accumulando ulteriori mutazioni nel tempo (54), mentre una seconda teoria suggeriva un’origine più orientale (55). Più recentemente, è stato dimostrato che le mutazioni che alterano la produzione della proteina antocianina possono verificarsi spontaneamente; quindi, il colore bianco può avere più origini (56). Ad oggi, il pip A32 archeologico è il più antico esemplare da identificare come un probabile uva bianca.

I risultati di questo studio dimostrano il potenziale delle piante antiche per fornire approfondimenti unici sulle antiche pratiche agricole. I semi di uva ben conservati scoperti nel Negev testimoniano la fattibilità di un’eccezionale conservazione molecolare anche nei climi caldi. L’eredità genetica di una vite tardiva di antichità può ora essere esplorata attraverso il lignaggio dell’uva vinificante che dimostra una notevole flessibilità essendo coltivata con successo in una serie di ambienti (dal deserto al temperato). Studi futuri della cultivar Asswad Karech possono rivelare il loci genomico responsabile della resilienza all’aridità. Inoltre, nell’attuale era del riscaldamento globale, i nostri risultati possono sostenere e guidare l’allevamento selettivo della vite volto a propagare le cultivar con la comprovata capacità di fare i conti con l’aumento delle temperature.

I metodi di ricerca

Campioni archeologici israeliani.

Deplorevole e datazione al radiocarbonio.

Dopo Elbaum et al. (57), 16 semi di uve antiche ben conservate sono stati selezionati per analisi del DNA e datazione al radiocarbonio utilizzando la spettroscopia a infrarossi di Fourier trasformata (appendice INR, capitolo 2). I pips provenivano dai siti archeologici di Shivta, Nessana e Avdat del sud di Israele nelle Highlands del Negev e del naufragio Ma’agan Mikhael B nella pianura costiera del nord di Israele (Fig. 1 e SI Appendice, Capitolo 1 e Tabella S1). Gli antichi pips erano divisi in due; una metà è stata inviata per l’estrazione del DNA, e quando ha avuto successo, l’altra metà è stata sottoposta a datazione al Dangoor Research Accelerator Mass Spectrometry Laboratory di Rehovot, in Israele. Le date al radiocarbonio sono state calibrate (fino a 2o; SI Appendice, Fig. S1 e Tabella S1) in OxCal 4.4 (https://c14.arch.ox.uk/oxcal/OxCal.html) utilizzando la curva di calibrazione IntCal 20 (58).

Estrazione del DNA, amplificazione e sequenziamento.

I campioni sono stati elaborati in strutture dedicate a CDNA presso l’Università di Tel Aviv, l’Università di Copenaghen e l’Università di York. I pips sono stati macinati in polvere fine usando un pestello e un mortaio. Il DNA è stato estratto seguendo il protocollo di estrazione del DNA dei resti archeobotanici del Galles e altri. (2014) (59). Maggiori dettagli in SI Appendix, Capitolo 3.

Le biblioteche del DNA sono state preparate sia per i metodi di sequenziamento del fucile (tutti i campioni archeologici) che per la cattura (campioni A31-A37). Per il sequenziamento del fucile, gli estratti di DNA sono stati convertiti in librerie di sequenziamento di Illumina a doppio filamento. Le librerie A31-A37 sono state costruite utilizzando NEBnext DNA Library Prep Mast Mix Set 2 (E6070L, New England BioLabs) con modifiche descritte da Wales et al. (60). Le librerie A140-A150 sono state costruite utilizzando il protocollo a monotubo con smussato (61). Per il sequenziamento del bersaglio di cattura, le librerie di campioni A31-A37 sono state arricchite per un set di 10.207 SNP secondo Ramos-Madrigal et al. 22(22) e Laucou et al. (28). Le biblioteche sono state catturate dopo il protocollo myBaits versione 3.0.

La PCR è stata eseguita su un volume totale di 100/25 L:2/0,5 ?L di un indice unico di oligo (10 ?M) e primer IS4 (10 ?M) 62(62) per la cattura e il sequenziamento del fucile, rispettivamente. La concentrazione di DNA è stata misurata utilizzando il Qubit dsDNA ad alta sensibilità (HS) Assay Kit (InvitrogenTM) seguendo il protocollo del produttore, e il DNA è stato anche quantificato e visualizzato per la distribuzione della lunghezza utilizzando i nastri DNA D1000 ad alta ensattività su TapeStation 4200 (Agilent Technologies). Infine, le librerie di DNA sono state raggruppate in base alla compatibilità dell’indice e alla molarità del campione. Le librerie sono state sequenziate su una piattaforma HiSeq Illumina 2500. Maggiori dettagli sulla procedura di sequenziamento nell’Appendice SI, capitolo 3.

Elaborazione dei dati sequenziati.

Le letture duplicate PCR sono state rimosse utilizzando uno script personalizzato, quindi sono rimaste solo sequenze univoche. La contaminazione degli adattatori è stata rimossa utilizzando il software LeeHom 63(63) e le letture di bassa qualità e le letture più brevi di 25 bp sono state rimosse utilizzando la versione 0.36 (64).

I campioni archeologici sono stati mappati all’assemblaggio del genoma di riferimento della vite (12X.v2) (65) utilizzando la versione 2.2.5 (66). Le letture mappate sono state valutate per i modelli SI Appendixdi danno aDNA (24) utilizzando mapDamage versione 2.0 (25) per affermare che i campioni sono effettivamente antichi (, Fig. S 2). Abbiamo anche usato mapDamage per ridimensionare l’antica qualità delle basi di sequenza e migliorare la mappatura e ridurre il numero di errori di chiamata genotipi derivanti da danni di tipo aDNA. Cfr. la descrizione dettagliata di SI Appendix, Capitolo 4 e Tabelle S6 e S7, sulle misure adottate per evitare errate denunciano il danno da deaminazione come polimorfismo. Abbiamo anche escluso che si è allineato più di una volta con il genoma di riferimento con il loro secondo migliore allineamento con meno del doppio del numero di disallineamenti come il miglior allineamento. Dopo questa fase, cinque campioni antichi sono stati eliminati a causa di un basso numero di letture rimanenti (20.000 sterline), lasciando nove campioni.

Campioni moderni nativi israeliani.

Il campionamento.

Per questo studio sono stati campionati un totale di 33 giovani tessuti fogliari di vitigni indigeni. Campioni di varietà domestiche autoctone sono stati raccolti dal Sataf Rescue Garden vicino a Gerusalemme e dalle piante che crescono selvagge lungo la costa meridionale di Israele (16). I campioni ritenuti varietà selvatiche autoctone sono stati raccolti dal nord di Israele (14) (Fig. 1 e SI Appendice, tabella S2).

Estrazione del DNA, amplificazione e sequenziamento.

I tessuti giovani sono stati elaborati in moderne strutture di laboratorio del DNA all’Università di Tel Aviv e presso la UMR AGAP Genotyping Platform (Montpellier, Francia). Usando un pestello e un mortaio, i campioni sono stati macinati in polvere fine mentre erano sotto azoto liquido. Il DNA è stato estratto utilizzando il DNeasy Plant Kit (QIAGEN Inc.) seguendo il protocollo del produttore. Attraverso microsatelliti (semplici ripetizioni di sequenza) confronto con il pannello di riferimento Refseq (28), sono stati identificati 15 cloni di cultivar di pannelli e tra i campioni stessi, e infine sono stati sequenziati solo 18 campioni unici. Le librerie di illumina sono state catturate presso la UMR AGAP Genotyping Platform seguendo il protocollo myBaits presentato da Ramos-Madrigal et al. (22). Il sequenziamento dell’Illumina è stato effettuato dalla struttura GeT-PlaGe (INRAE, Genotoul, Francia).

Elaborazione dei dati sequenziati.

Le letture grezze sono state demultiplexed utilizzando il programma Je versione 2.0.2 (67); sono state rimosse le letture duplicate e le letture di bassa qualità e le contaminazioni degli adattatori sono state tagliate o rimosse utilizzando la versione 0.36 di Trimmomatic, lasciando sequenze che erano lunghe almeno 75 bp. Successivamente, le letture sono state allineate al genoma di riferimento della vite usando Bowtie2. Le letture che erano allineate con più di due disallineamenti e un’apertura del divario sono state filtrate. Abbiamo anche escluso più letture allineate come descritto sopra. Dopo questa fase, cinque campioni sono stati eliminati a causa di un basso numero di letture rimanenti (20.000 sterline), lasciando 13 campioni.

Sequenze integrali a medio genoma pubblicamente disponibili.

Le sequenze Vitis di tutto il genoma disponibili pubblicamente sono state scaricate dal database NCBI. Abbiamo ottenuto un totale di 126 campioni dalle adesioni di bioprogetto di archivio a lettura breve PRJNA647155 (19), PRJNA388292 (30), e PRJNA393611 (31), selezionati in base alla loro qualità di sequenziamento (SI Appendice, Tabella S3), e per l’ultimo bioproject, sulla base del nome del catalogo delle uve Vitis International Variety Catalogue (VIVC) e con Lacombet. (68). I campioni sono stati elaborati come descritto sopra per i moderni campioni nativi israeliani.

Costruzione di dati SNP.

Gli SNP che richiedono campioni moderni e antichi sono stati eseguiti utilizzando i protocolli HaplotypeCaller e GenotypeGVCFs della conduttura GATK (69). Complessivamente sono stati identificati 15.44.158 SNP. Circa 9.988 di loro sono stati inclusi nell’array 10K SNP per il quale sono stati arricchiti i campioni catturati. I restanti tre campioni antichi del fucile, uno catturato antico campione e nove dei campioni nativi con copertura inferiore a uno in questo array SNP sono stati eliminati, lasciando solo cinque campioni antichi, tutti da Avdat, e nove campioni nativi (SI Appendice, Tabelle S1 e S2).

Successivamente, i genotipi di 783 coltivati e 112 campioni di vite selvatiche dei pannelli di diversità GrapeReSeq descritti da Laucou et al. (28) e da Le Paslier et al. (29), rispettivamente, sono stati incorporati nel catalogo del genotipo. Da questo catalogo, abbiamo creato due set di dati SNP separati da utilizzare nelle analisi: uno comprendeva tre campioni antichi e 6.928 SNP e gli altri tutti e cinque i campioni antichi e 1.032 SNP. Per ogni set di dati, abbiamo usato VCFtools (70) per affermare che ogni locus aveva una chiamata di genotipo in almeno il 75% dei campioni, e ciascuno dei campioni aveva chiamate di genotipo in almeno il 60% del loci con la profondità di lettura minima di cinque (per i campioni non panel). In tutte le seguenti analisi, i criteri di qualità sopra menzionati sono stati mantenuti o resi più rigorosi.

PCA.

Abbiamo eseguito un PCA utilizzando la decomposizione dell’approccio della matrice della covarianza eseguendo la funzione prcomp implementata in R con i parametri predefiniti e la scala-TRUE quando possibile. I risultati sono stati tracciati utilizzando i pacchetti R factoextra e ggplot2. I campioni sono stati geograficamente classificati secondo Bacilieri et al. (55) con alcune modifiche e hanno incluso solo adesioni campionate in Europa, Asia occidentale e centrale e Nord Africa. L’elenco completo dei paesi e dei loro gruppi geografici è disponibile nell’Appendice SI, capitolo 8.

Nel PCA che includeva solo i campioni del Levantino meridionale, la funzione R stat-ellipse è stata utilizzata per calcolare e disegnare ellissi con un livello di confidenza del 95% intorno ai campioni coltivati e selvatici assumendo una distribuzione multivariata t.

Analisi della parentela.

Abbiamo dedotto la parentela tra le adesioni del Levante meridionale in due modi diversi:

introduzione e inferenza dei genotipi dei segmenti IBD.

Utilizzando tutte le adesioni disponibili, abbiamo utilizzato solo loci con una frequenza di allele minore (MAF) del 3% che aveva chiamate di genotipo in almeno l’80% dei campioni, lasciando 6.896 e 1.030 SNP, rispettivamente di set di dati. I dati genetici sono stati imputati e phaseed per dedurre le lunghezze dei segmenti IBD condivisi utilizzando Beagle e software IBD raffinato (7171-1973). Utilizzando questo approccio combinato, i segmenti IBD che sono condivisi con una copia aplotica (IBD1) sono costruiti stochasticamente e i genotipi mancanti vengono imputati utilizzando il modello di catena Markov nascosto. Il logaritmo del punteggio di probabilità (LOD) dei segmenti candidati è calcolato in base al rapporto di probabilità in un IBD rispetto a un modello nonIBD. Siamo stati in grado di identificare un totale di 146.423 e 42.676 segmenti di aplotipo IBD con LOD 3 tra tutte le coppie di campioni del Levante meridionale, rispettivamente del set di dati SNP. Abbiamo utilizzato le lunghezze sommate degli aplotipi condivisi tra ogni coppia di campioni per dedurre la loro relativa relazione. Questa analisi e l’inepto degli aplotipi a fasi tra A33 e Asswad Karech sono le uniche analisi che utilizzano set di dati SNP imputati. Per il set di dati SNP più grande, i campioni sono stati ordinati e raggruppati utilizzando la libreria R pheatmap.